近年来，杂种优势利用途径不断丰富，通过不同杂优利用途径的各种杂交油菜新品种在各个油菜主产区不断涌现，其中杂优利用的主要途径有细胞质雄性不育(CMS)、细胞核雄性不育(GMS)以及化学杂交剂诱导雄性不育(CHA)等(傅廷栋, 1990)。几种杂优利用途径虽各有特点，但因细胞质雄性不育途径不育系培育周期长，并常出现微量花粉，在制种时可能出现母本自交而影响种子纯度；核不育途径的杂种制种繁琐，需拔除50%的可育株，实际应用较困难；通过化学杀雄途径创制杂种具有独特的优势，如杂交组合选配自由、不用培育专门的不育系和恢复系，这避免了对某一胞质的依赖性，有利于育成强优势组合，且杂种中不会出现不育株，推广风险小、收益高，同时育种时间较三系及核不育杂种相对更短等。近年来利用化学杀雄技术已先后培育出了涪优1号、蜀杂2号、蜀杂5号、渝黄1号、渝黄2号、化杀3号、杂油05、秦优33、秦优19、秦杂油4号、秦荣2号、秦优79、湘杂油1号和湘杂油6号等一批油菜品种，种植面积已逾l×10⁵ hm²。

秦杂油19是陕西省杂交油菜研究中心应用化学杀雄技术培育的高油双低甘蓝型油菜品种，含油量达到了49.49%，杆硬抗倒，耐菌核病，适宜于中国春油菜地区种植，至2011年通过国家审定以来，因丰产优势显著而得到迅速推广，年种植面积在春油菜区占70%以上，成为春油菜区的主栽品种。但优良的品种还必须依靠高纯度的种子作保证，才能充分发挥优良品种的作用。为此，对化学杀雄杂交油菜品种秦杂油19的商品种进行纯度鉴定是其种子质量控制环节最重要的内容之一。

传统种子纯度鉴定方法一般采用籽粒形态观察、田间种植鉴定、同工酶以及种子储藏蛋白等鉴定技术(罗黎明等, 2011)。这些方法虽然简便易行，但是均存在一定的缺陷，然而近些年，分子标记技术已广泛应用于种子的真实性检测和纯度分析中(方宣钧等, 2000)，常用的分子标记有RAPD、SSR等，SSR技术具有多态性强、稳定性高，操作简便、经济实用而越来越多地应用于各种农作物的种子纯度鉴定，水稻(谭孟君等, 2008)、玉米(王邦太等, 2011)、小麦(石海波等, 2006)、油菜(王灏等, 2009; 李媛媛等, 2007)、棉花(许兰杰等, 2008)。本研究利用SSR分子标记技术对化学杀雄杂交油菜品种秦杂油19及其亲本进行SSR分析，建立了秦杂油19种子纯度的快速分析方法，为保证该品种和类似品种的种子质量安全和生产应用提供方法探讨和技术支持。

1结果与分析
1.1引物筛选
利用800对引物对手工杂交所制的秦杂油19及其亲本的混合DNA进行扩增，能扩增出条带的引物共627对，所获得的条带数在1~16条之间，在这些引物中，多数引物在三者之间并无差异，其中杂种与母本带型一致的引物73对，杂种与父本带型一致的引物43对，其中能将杂种及亲本完全区别且条带清晰，特异性强、的引物5对：SR303、SR767、SR790、SR786和SR487 (图1A)，由图1可以看出这5对引物所获杂种SSR结果均具双亲交叉互补带型，对杂种的扩增条带数在2~10条之间，片段长度分别在100~1 600 bp之间，分布均匀、清晰可靠。其中，SR767和SR790扩增带型为互补型，在种子纯度鉴定中，这些带型皆是较为理想的类型，可作为秦杂油19鉴定的候选引物，所获对应SSR电泳结果即为标准图谱(图1B; 图1C)。

图1 5对SSR引物(A)以及SR767 (B)和SR790 (C)对秦杂油19和其亲本扩增结果 注: M: DL1500 marker; 1~10: 母本; 11~20: 秦杂油19; 21~30: 父本 Figure 1 The amplified result of five pairs of primers (A), SR767 (B) and SR790 (C) for Qinzayou 19 and parents Note: M: DL1500 marker; 1~10: Female; 11~20: Qinzayou 19; 21~30: Male

1.2所得到的SSR标记在杂种鉴定中的稳定性
为了避免引物在混合DNA中扩增出的带型不能反映所有单株的基因型，因此需要用筛选出的引物对杂种及其亲本进行一致性和稳定性验证。本研究应用所选引物SR767和SR790对人工授粉制种的秦杂油19和两亲本单株各150株，分别提取单株DNA进行扩增验证(图2; 表1)。

图2 引物SR767对母本(A)、秦杂油19(B)和父本(C)部分单株分析结果 注: F: 母本; H: 秦杂油19; M: 父本; A中1~14,18~31代表母本; B中1~14,18~31代表秦杂油19; C中1~14,18~31代表父本 Figure 2 The analyzed result of partly single plant with qinzayou 19 hybrid (B) and parents (A; C) Note: F: Female; H: Qinzayou 19; M: Male; 1~14,18~31 represent Female in figure A; 1~14,18~31 represent Qinzayou 19 in figure B; 1~14,18~31 represent Male in figure C

表1 引物SR767及SR790扩增秦杂油19及其亲本单株与标准图谱一致性对照 Table 1 The consistency control between single pattern and standard pattern of qinzayou 19 with it's parents by primer SR767 and primer SR790

引物SR767在150株样品中，扩增出的带型稳定，基本上与标准带型相一致，母本只有1 600 bp一条带，父本也只有1 300 bp一条带，杂种兼有1 600 bp和1 300 bp两条带，杂种及父母双亲的一致性比例分别为母本97.33%、杂交种98.00%、父本100%；引物SR790在150株样品中，母本只有420 bp一条带，父本也只有490 bp一条带，杂种兼有420 bp和490 bp两条带，杂种及父母本的一致性比例分别为母本98.67%、杂交种96.67%、父本98.00%。两对引物均扩增清晰，带型稳定，可以用来进行化学杀雄油菜品种秦杂油19种子鉴定。

1.3两对SSR引物之间稳定性比较
2011年花期，利用两对引物对田间种植的3份样品进行分子鉴定，部分结果见图3和图4，其中引物SR767泳道7、10、16、25和35表现为母本带型，其余均为杂种带型；引物SR790泳道10、16、25和35表现为母本带型，泳道4表现为父本带型，其余均为杂种带型。统计显示见表2，两对引物检测结果吻合率达到96%以上，两者之间最大偏差仅为1.65，检测结果间的差异是不显著的，表明两对引物均可进行秦杂油19种子的纯度检测。

图3 引物SR767对秦杂油19田间植株鉴定结果 注: 10,16,25,35: 母本; 5: 父本; 其余为秦杂油19 Figure 3 Identification result of primer SR767 for Qinzayou 19 in planting Note: 10,16,25,35: Female; 5: Male; The rest are Qinzayou 19

图4 引物SR790对秦杂油19田间植株鉴定结果 注: 7,10,16,25,35: 母本; 其余为秦杂油19 Figure 4 Identification result of primer SR790 for Qinzayou 19 in planting Note: 7,10,16,25,35: Female; The rest are Qinzayou 19

表2 引物SR767和引物SR790之间稳定性比较 Table 2 The stability comparison between primer SR767 and primer SR790

2讨论
秦杂油19及其的性状表现无论在大田还是分子标记水平，均表现出一定的亲子关系。在分子水平上杂种的SSR带型表现有5种，即：共有型、偏母型、偏父型和交叉互补型，以及概率较少与双亲皆不同的杂种特异型，其中和双亲一致的带型表现最多。大田的形态性状表现可分为偏亲型、中间型和超亲型，偏亲型有时会因发育阶段的不同常存在变化，如杂种在一个生长时期表现出明显的母本效应，而在另一些发育阶段则显示偏父性或中间型，发育阶段的不同偏亲表现可能出现差异，因此形态学性状鉴定完全不象分子标记结果那样准确清晰，很多似是而非，给鉴定和判断造成较大的困难，不仅对鉴定人员要求高、检测周期长，而且出现较高的误检率。而基于物种基因组DNA分析基础之上的SSR技术，分析的目标物是其直接的遗传物质DNA，其结果不受环境干扰，所以对种子的属性认定，更精准、更可靠，不受季节、区域和种植条件的限制，已广泛应用于种子纯度鉴定中。

本研究利用聚丙烯酰胺凝胶分离技术，从800对SSR引物中筛选出可将秦杂油19及其亲本区分的引物5对，并利用其中两对引物SR767和SR790分别对秦杂油19及其双亲单株进行了一一验证，结果显示，两对引物对杂种和双亲的各单株分析结果与各自的标准带谱比较对应率极高，均达到了96%以上，个别达到了100%，说明两引物用于秦杂油19的纯度分析是可靠的、稳定的。同时利用该两对引物对秦杂油19生产用种的种子纯度进行了分析鉴定，结果显示，两对SSR引物分析结果的单株吻合率在96.67%~98.32%之间，吻合度极高。本研究利用不同SSR引物对秦杂油19杂种及其双亲单株和生产用种的鉴定结果表明，应用SSR分子标记进行化学杀雄品种秦杂油19的种子鉴定，方法可靠、结果准确，分析快捷、不受自然条件限制，是进行杂种种子纯度检测的有力工具。

 在利用SSR对所有的目标群体鉴定过程中，无论是父母本还是杂种，皆会经常出现极少数与标准谱带结果不一致的非对应性结果和单株属性偏差(穆建新等, 2010)，其原因除个别单株混杂外，可能更由于基因型材料系统内的目标分析位点还不是绝对的纯合(汤天泽等, 2008)。目前我们所用的亲本材料无论是多代自交而来，还是利用其他纯合手段所获，甘蓝型油菜作为异源四倍体其纯合度无疑是相对的，很难达到所有位点的绝对纯合。而SSR分子标记技术是对植株内基因组范围某区段的分析检测，只对目标序列进行扩增显示，结果灵敏，当目标分析区域出现不纯，后代单株自然会因遗传而出现个别样品的不对应性显示。如即使同一单株，在用不同引物或方法分析时，由于不同方法扩增的基因位点有差异，结果会显示不同，该单株的属性表现认定就会存异。那么，要克服亲本基因内部位点不纯的影响，其中有效方法之一便是利用相应的分子鉴定技术对原始亲本进行提纯筛选，将不纯合的亲本淘汰，利用纯化后的原原种亲本进行杂交制种。其中利用筛选提纯的手段或方法越多，种子的纯合度就越高。

3材料与方法
3.1材料
供试材料为生产中大面积生产应用的甘蓝型油菜化学杀雄杂交品种秦杂油19 (Hybrid, 简称H)及其高纯母本双低诱导型不育系YD18A (Female, 简称F)、父本P563 (Male, 简称M)。其中秦杂油19样品有手工杂交和大田生产制种等不同来源。且以上材料均由陕西省杂交油菜研究中心提供，田间试验和室内实验均在陕西省杂交油菜研究中心完成。

3.2方法
3.2.1 DNA的提取
油菜花期将手工杂交的秦杂油19及对应亲本各选10~15株，每株取嫩叶一片，用SDS纯化法提取DNA，用于引物筛选。单株DNA的简便提取参考(王灏等, 2002)并略有改进。即取发芽一周的单株幼芽于1.5 mL离心管，加入小钢珠、50 μL氯仿和300 μL预热提取液(50 mmol/L Tris-HC1, 50 mmol/L EDAT, 500 mmol/L NaCl, l0 g/L PVP, 10 mL/L β-巯基乙醇, 20 g/L SDS, pH 8.0)，振荡匀浆1~3 min，65℃水浴30 min后，加入5 mol/L KAC 75 μL冰浴静置15 min，12 000 r/min离心10 min；取上清液加入-20℃预冷的2倍体积异丙醇冷冻30 min，12 000 r/min离心5 min，弃上清，加70%乙醇清洗1~2次，风干备用。

3.2.2 SSR分析
引物来自The Plant Biotechnology Centre，澳大利亚生物技术中心等，由上海Sangon公司合成。PCR反应的总体积为10 μL，包含2 μL的25 ng/μL模板DNA，1 μL的10×Taq 酶Buffer，0.8 μL的25 mmol/L MgCl₂，0.2 μL的10 mmol/L dNTPs，0.5 U Taq DNA聚合酶，SSR引物各25 ng。PCR反应在Eppendorf AG 22331 Hamburg PCR反应以上进行，反应程序为：94℃预变性4 min，94℃ 1 min，60℃ 30 s，72℃，此后每个循环退火温度降低0.5℃，共10个循环，然后94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 45 s，30个循环，72℃ 5 min，4℃保存。PCR扩增产物加1/2体积的变性上样缓冲液95℃变性5 min立即冰浴冷却，在6%的变性聚丙烯酰胺凝胶上300 V恒压电泳2 h分离。经染色、显影后，拍照记载样本基因型(梅德圣等, 2006)。

3.2.3验证筛选引物在杂种及其亲本中的一致性和稳定性
将手工杂交所获秦杂油19杂交种和对应亲本各150株发芽提取单株DNA，然后用筛选出来的引物进行扩增，将扩增的DNA图谱与标准图谱进行比较，进而验证筛选出的引物在杂种及其亲本中的一致性和稳定性。

3.2.4田间种植鉴定
试验于2010年9月-2011年5月在陕西省杂交油菜研究中心进行，将混有不同数量亲本的待测样品随机混匀播种，播种密度为45株/m2，不间苗，在初花期采集样品花蕾提取DNA，利用引物SR767和引物SR790分别对三份不同样品进行SSR分子鉴定，记录结果，对不能相互对应的进行反复验证，确定准确无误后，计算两对引物鉴定结果的吻合率。

作者贡献
李保军、王爱娜、王晓东和罗斌是本研究的实验设计和实验研究的执行人；赵亚军、赵卫国和李建厂完成田间数据的收集和分析；王灏和栗茂腾参与论文的写作和修改；李殿荣、田建华是项目的构思者；王灏是实验的构思着和负责人，指导实验设计，数据分析，论文写作与修改。全体作者都阅读并同意最终的文本。

致谢
本研究由陕西省自然科学基础研究计划重点项目(2012JZ3001)、渭南市科技创新扶持资金项目(2012-KYJ-1)和农业部油菜现代产业技术体系建设项目(CARS-13)共同资助。感谢陕西省杂交油菜中心张文学老师和任军荣老师在本研究过程中提供的帮助。

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